摘  要：奶牛乳房炎是影響奶牛生產(chǎn)的主要疾病之一。病原菌的免疫抑制以及日趨嚴(yán)重的耐藥性，致使乳房炎的發(fā)病率增高且治愈困難，給世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。實(shí)踐表明，疾病的診斷是疾病病因和治療之間較重要的一步。經(jīng)濟(jì)、快速、可靠的診斷工具是乳房健康管理的基礎(chǔ)。本文主要論述了奶牛乳房炎不同診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及新興診斷技術(shù)的研究進(jìn)展。
關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；病原菌；診斷
奶牛乳房炎又稱(chēng)奶牛乳腺炎（Bovine mastitis），是奶牛乳腺受到物理、化學(xué)或微生物等刺激所發(fā)生的一種炎癥反應(yīng)，其發(fā)生范圍廣、發(fā)病率高。據(jù)報(bào)道，在一些國(guó)家，每頭奶牛因乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)107~344美元[1]，所以奶牛乳房炎的控制和治療策略尤為重要，其中，致病病原體的鑒定是至關(guān)重要的基礎(chǔ)。引起奶牛乳房炎的致病菌包括細(xì)菌、真菌、病毒等，但一般以細(xì)菌為主。據(jù)報(bào)道，在奶牛乳房炎病例中已鑒定出130多種不同的微生物[2]。引起奶牛乳房炎的細(xì)菌可分為環(huán)境型（大腸桿菌、克雷伯氏菌屬和綠膿桿菌等）和傳染型（金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、化膿性假單胞菌和支原體屬等）。90%以上的乳房炎是由金黃色葡萄球菌、鏈球菌以及大腸桿菌引起[3]。特別是金黃色葡萄球菌，它是引起奶牛乳房炎較重要的病原菌，在全球各地的奶牛場(chǎng)均普遍存在。金黃色葡萄球菌免疫抑制較強(qiáng)，多在泌乳高峰期感染奶牛，感染的牛只多為慢性發(fā)病，但有時(shí)也會(huì)急性發(fā)病，因治愈困難、復(fù)發(fā)率高，給奶牛場(chǎng)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。
1、奶牛乳房炎的診斷方法
奶牛乳房炎通常分為兩類(lèi)：臨床型乳房炎和亞臨床型乳房炎（即隱性乳房炎）。由于臨床型乳房炎眼觀明顯，所以本文僅對(duì)亞臨床型乳房炎診斷展開(kāi)論述。
傳統(tǒng)的亞臨床型乳房炎檢測(cè)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、假陰性結(jié)果較多且靈敏度低下等不足。尤其作為乳房炎鑒定的黃金標(biāo)準(zhǔn)——微生物培養(yǎng)，雖然對(duì)生物體在抗生素的選擇使用方面具有許多優(yōu)勢(shì)，但對(duì)于密切相關(guān)的病原菌鑒定卻不是很準(zhǔn)確。據(jù)Makovec等[5]報(bào)道，該方法的變異性較大，在乳房炎乳汁樣品的微生物培養(yǎng)中產(chǎn)生了27%~50%的假陰性。正因?yàn)檫@些傳統(tǒng)方法的不足，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)展了大量新研究，希望能夠更好地完善奶牛乳房炎診斷技術(shù)。目前，紅外技術(shù)、生物傳感技術(shù)以及納米技術(shù)等新技術(shù)已相繼應(yīng)用到該領(lǐng)域，但尚未完全成熟，需要進(jìn)一步的研究及驗(yàn)證才可應(yīng)用到實(shí)際。在新興技術(shù)中，實(shí)時(shí)熒光多重PCR在人醫(yī)和獸醫(yī)領(lǐng)域都頗受歡迎。該技術(shù)檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確，具有高特異、高靈敏度等特點(diǎn)，就目前來(lái)看是當(dāng)前奶牛乳房炎診斷較合適的替代方案。
紅外技術(shù)
據(jù)Johnzon等[6]研究表明，炎癥反應(yīng)與乳房炎致病因子的毒力相關(guān)，但要進(jìn)一步研究才能找到促炎因子與乳腺炎的關(guān)系。Schabauer等[7]報(bào)道，傅里葉變換紅外（FTIR）光譜技術(shù)基于對(duì)生物體DNA的識(shí)別，通過(guò)物種的光譜與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中已知物種的光譜進(jìn)行比較，可以區(qū)分密切相關(guān)的物種。此外，F(xiàn)TIR光譜學(xué)還被證明是一種適用于流行病學(xué)調(diào)查和追蹤污染源的工具[8~10]。研究表明，一旦建立并安裝了基于該技術(shù)的系統(tǒng)，就可以準(zhǔn)確且低成本地檢測(cè)出乳腺病原體，從而可以更早地對(duì)臨床型乳房炎進(jìn)行診斷與治療。目前，這項(xiàng)技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中受到越來(lái)越多的關(guān)注。Martins等[11]為了尋求簡(jiǎn)單可靠的檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)紅外熱像儀（ITR）進(jìn)行監(jiān)測(cè)，證明了亞臨床型病例與健康奶牛相比具有更高的乳房溫度。溫度反映了組織代謝和血液循環(huán)的狀態(tài)，異常的熱模式表示淺表炎癥或循環(huán)障礙的區(qū)域。ITR監(jiān)測(cè)紅外輻射發(fā)射的表面熱量，而熱成像儀吸收紅外輻射并根據(jù)產(chǎn)生的熱量生成圖像[12]。在捕獲圖像前，將相機(jī)校準(zhǔn)到環(huán)境溫度且將溫度測(cè)量值調(diào)整為攝氏度，在距離乳房1.0m于擠奶前采集乳房的熱像圖像，記錄下乳房表面較高溫度進(jìn)行分析，從而對(duì)患畜與健康牛只進(jìn)行分類(lèi)。據(jù)研究表明[13]，紅外熱像儀的敏感性和特異性分別為95.6%和93.6%。雖然其敏感性和特異性很高，但在實(shí)際操作中卻很費(fèi)力，且阻礙較多，還有待進(jìn)一步的研究。
生物傳感技術(shù)
在診斷領(lǐng)域，我們不能忽視在乳房炎發(fā)病前或治療前的奶牛行為變化。Avery綜合研究結(jié)果顯示，奶牛在采食量和總體活動(dòng)方面變化顯著，這些變化在臨床癥狀出現(xiàn)前幾天就很明顯，所以可作為監(jiān)測(cè)的指標(biāo)[14]。為此，Stangaferro等[15]開(kāi)發(fā)了一種可以記錄反芻動(dòng)物活動(dòng)與自身健康的自動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，當(dāng)與其他傳統(tǒng)診斷結(jié)合使用時(shí)，被證明是有效的方法，但需要在管理領(lǐng)域取得進(jìn)一步進(jìn)展才能較大限度地發(fā)揮效益。Yazdanbakhsh等[16]開(kāi)發(fā)了動(dòng)物傳感器與智能監(jiān)控相關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)在疾病發(fā)作前幾天就可以對(duì)奶牛進(jìn)行疾病的監(jiān)測(cè)。然而，常規(guī)使用需要進(jìn)一步推進(jìn)它的高度特異性和敏感性。Zhang等[17]整合了電子動(dòng)力學(xué)和生物傳感技術(shù)，有助于達(dá)到耗時(shí)短、靈敏度高的目的。Ganda等[18]發(fā)現(xiàn)其易于執(zhí)行，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)際結(jié)果與16S rRNA測(cè)序結(jié)果相當(dāng)。隨著該系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展，用于乳房炎診斷將在牧場(chǎng)中變得更加可行，特別是在診斷與乳房炎相關(guān)的微生物群體上，可以觀察到具有不同疾病狀態(tài)和疾病史乳頭的細(xì)菌群落的顯著差異。通過(guò)采取預(yù)防措施，可以改善牛群的健康狀況，從而提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力和動(dòng)物福利。
Chinnappan等[19]開(kāi)發(fā)了基于磁性納米顆粒的量熱測(cè)定法用于檢測(cè)乳中的纖溶酶水平。纖溶酶是一種熱穩(wěn)定的內(nèi)源性絲氨酸蛋白酶，無(wú)論涉及何種病原體，它都會(huì)釋放出來(lái)[20,21]。隨纖溶酶水平的增加，底物被切割，肽片段附著在磁性物上的珠子將被傳感器下面的磁鐵吸引，露出金色表面。研究發(fā)現(xiàn)，金色表面的面積與纖溶酶活性成正比。因此，該方法主要就是通過(guò)比色分析來(lái)區(qū)分健康牛與患牛。這種比色生物傳感器反應(yīng)快速、簡(jiǎn)單、敏感，在乳腺炎診斷過(guò)程中有很強(qiáng)的潛力且可能用作初始階段的診斷。Peedel和Rinken[22]設(shè)計(jì)了另一種用于快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的生物傳感器。它由可再生的微柱和用于選擇性結(jié)合靶細(xì)菌的二抗和共軛熒光標(biāo)記物組成。Duarte等[23]基于磁性納米粒子與特異性抗體的結(jié)合特性，采用具有微流體樣品的磁阻細(xì)胞儀檢測(cè)金黃色葡萄球菌，與常規(guī)方法相比，提高了效率。
蛋白質(zhì)組學(xué)分析
基于基因分析的乳房炎診斷方法正變得越來(lái)越頻繁。基因分析可用于測(cè)試已從牛奶中分離的細(xì)菌，或直接檢測(cè)其在牛奶中的存在[24]。當(dāng)代科學(xué)用可以識(shí)別乳腺炎癥狀的生物標(biāo)志物設(shè)計(jì)新的診斷測(cè)試，以快速檢測(cè)出乳腺感染，而蛋白質(zhì)組學(xué)分析就是這些工具之一[25,26]。研究表明，亞臨床型乳房炎乳清中的蛋白質(zhì)表達(dá)模式較健康牛只發(fā)生了改變[27]。急性期蛋白（APP）是在急性炎癥反應(yīng)期間在肝臟中構(gòu)建的蛋白質(zhì)，在正常狀態(tài)下較低，但在各種炎癥的刺激下會(huì)迅速升高，而當(dāng)病愈或得到有效治療時(shí)其水平又會(huì)立即恢復(fù)正常。反芻動(dòng)物較為敏感的急性期蛋白是結(jié)合珠蛋白（HP）和血清淀粉樣蛋白A（SAA），這兩者在急性炎癥發(fā)生時(shí)會(huì)大量增加。有研究指出，乳汁中SAA的增加較為明顯[28]。Hussein等[29]則研究發(fā)現(xiàn)MAA（乳淀粉樣蛋白A）優(yōu)于其他亞臨床型乳房炎診斷標(biāo)志物，優(yōu)勢(shì)在于健康動(dòng)物乳汁中微量甚至檢測(cè)不到的MAA水平，它不受乳房炎以外的其他因素的影響，并且可以在保存的樣品中估計(jì)，為臨床型乳房炎的診斷提供了有力的證據(jù)。Mansor等[30] 報(bào)道，這些生物標(biāo)志物可以作為準(zhǔn)確區(qū)分健康和患病狀態(tài)的潛在候選者，并能提供有關(guān)致病因子的一些信息。在較近報(bào)道的一項(xiàng)研究中，使用無(wú)標(biāo)記定量的方法可以確定由乳房鏈球菌引起的乳中蛋白質(zhì)表達(dá)的相對(duì)變化，與先前的報(bào)道相比，已經(jīng)證明它更有利并且能夠提供關(guān)于宿主對(duì)奶牛乳房炎更全面的信息[31]。
分子診斷
分子診斷是用于檢測(cè)常規(guī)方法難以檢測(cè)的乳房炎病原體物種的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)，包括LAMP、PCR和多重實(shí)時(shí)PCR等技術(shù)。這些基于核酸的檢測(cè)依賴(lài)于各種病原體的基因組序列。LAMP技術(shù)由Notomi等人開(kāi)發(fā)，它是一種新型的DNA擴(kuò)增方法，可以在等溫條件下擴(kuò)增靶基因[32] Sayad等[33]研究發(fā)現(xiàn)，LAMP（環(huán)介導(dǎo)）具有鈣黃綠素介導(dǎo)的量熱無(wú)線檢測(cè)系統(tǒng)，可在65min內(nèi)有效檢測(cè)病原體，尤其適用于金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)快速、經(jīng)濟(jì)、耗時(shí)短，其局限性主要是靈敏度低。在過(guò)去幾年中，它在診斷領(lǐng)域獲得了很大的普及，很有潛力被用作現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但在靈敏度的改良上仍然需要國(guó)內(nèi)外學(xué)者的共同努力。
與其他檢測(cè)技術(shù)相比，PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）診斷技術(shù)的特異性和敏感性優(yōu)勢(shì)十分顯著，是目前奶牛乳房炎臨床診斷中比較先前的一種分子水平檢測(cè)方法，Phuektes等[34]建立的一種以16S~23SrDNA間隔區(qū)為擴(kuò)增靶序列的多重PCR檢測(cè)方法，依據(jù)16S~23SrDNA在不同種的細(xì)菌中拷貝數(shù)、長(zhǎng)度、堿基排列順序及含有的tRNA基因的數(shù)量和種類(lèi)不同，可判斷致病菌的種類(lèi)。PCR不僅可以檢測(cè)細(xì)菌的種類(lèi)和重要的抗生素抗性基因，還可以檢測(cè)霉菌和病毒，也可用于混合培養(yǎng)傳統(tǒng) PCR的缺點(diǎn)是在DNA擴(kuò)增檢測(cè)中使用瓊脂糖凝膠，其分辨率非常差[35]。而多重實(shí)時(shí)PCR則在傳統(tǒng)PCR的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，通過(guò)熒光定量分析儀對(duì)提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)50℃、3min去污染，95℃、3min預(yù)變性，95℃、10S擴(kuò)增和60℃、40S退火等40個(gè)循環(huán)，根據(jù)分析軟件的Ct值就可以客觀地解釋各致病菌種的陽(yáng)性結(jié)果。Mahmmodp等[36,37]報(bào)道，奶牛乳房炎致病菌陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量與Ct值截止值的選擇相關(guān)，與劑量反應(yīng)效應(yīng)相當(dāng)?，F(xiàn)國(guó)內(nèi)少數(shù)地區(qū)已使用該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)監(jiān)控亞臨床型乳房炎，如上海就是通過(guò)PathoProof乳房炎多重PCR診斷系統(tǒng)對(duì)單一反應(yīng)孔16種重要的病原菌進(jìn)行基因診斷。該16聯(lián)牛乳房炎病原菌核酸檢測(cè)采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，針對(duì)引起牛乳房炎常見(jiàn)的病原菌特有的DNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，通過(guò)PCR擴(kuò)增觀察是否產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大熒光信號(hào)可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶樣品中引起奶牛乳房炎的病原菌種類(lèi)。多重PCR主要用于常見(jiàn)的炎癥病原體，與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比，PCR診斷技術(shù)敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)方便、耗時(shí)短且結(jié)果更加準(zhǔn)確。
2、展望
近幾年來(lái)，奶牛養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模不斷壯大，但隨之而來(lái)的疾病也在不斷高發(fā)，僅乳房炎就給牧場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者為了更好地診斷和維護(hù)乳房的健康，在生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域做了很大的投入，并取得了相當(dāng)大的進(jìn)步，特別是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法的結(jié)合，以及納米治療技術(shù)和其他傳感器的進(jìn)一步參與，將有助于尋求更好的乳房炎診斷工具。就目前的診斷方法而言，多重實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)，反應(yīng)快速、結(jié)果準(zhǔn)確且特異性強(qiáng)、靈敏度高，是當(dāng)前用于奶牛乳房炎診斷的較合適的替代方案。當(dāng)前，雖然奶牛乳房炎診斷技術(shù)不斷進(jìn)步，成果頗多，但推廣力度始終不夠。所以為了突出這些技術(shù)在奶牛行業(yè)的影響，應(yīng)該提供更多的理論知識(shí)和指導(dǎo)來(lái)傳遞這些新穎的先進(jìn)技術(shù)，使這些技術(shù)不僅僅只局限于少數(shù)實(shí)驗(yàn)室，而是能真正走進(jìn)各大牧場(chǎng)，走進(jìn)奶牛行業(yè)。